Nel 1937 dà vita con Jerry Iger allo studio di fumetti "Eisner & Iger", per il quale lavoreranno tra l'altro Bob Kane, futuro autore di Batman, Jack Kirby, che diventerà un famoso disegnatore di supereroi, e Jules Feiffer, futuro maestro del fumetto satirico. Utilizzando anche diversi pseudonimi, Eisner dà vita a numerosi personaggi, tra i quali dobbiamo ricordare almeno Wild Tex Martin e la lunga storia di pirati Hawks of the Seas (firmato Willis B. Rensie); nel 1938 con Iger crea anche Sheena, Queen of the Jungle la prima e più famose delle tarzanidi a fumetti, per la quale realizza però soltanto alcune copertine, matite e rare inchiostrazioni.
Nel 1940 è chiamato dalla Quality Comics a realizzare un supplemento domenicale di otto pagine, il Weekly Comic Book, da distribuire con diverse testate quotidiane: cede dunque la sua quota dello studio a Iger e si lancia nella nuova avventura, creando il suo personaggio più famoso, The Spirit, mediamente di 7 tavole a episodio, completate da una tavola umoristica di Feiffer.
Richiamato alle armi nel 1942, affida il suo affascinante detective mascherato ad altri autori, tra i quali possiamo ricordare almeno Jack Kirby, Joe Simon e Wallace Wood, ma riesce a seguirne comunnque la produzione. Lo riprende nel 1946 e continua fino al 1952, quando in considerazione della mutazione subita dal mercato, si dedica alla pubblicità.
L'attenzione verso The Spirit riprende alla fine degli anni Sessanta, con il boom del fumetto di quegli anni, ed Eisner torna a occuparsi di fumetti negli anni Settanta, collaborando estemporaneamente con alcune fanzine e pubblicazioni underground (come quando realizza lacopertina del n. 3 di Snarf nel 1972) realizzando illustrazioni, copertine, storie senza personaggi fissi. Nel 1978 la Kitchen Sink comincia la pubblicazione di The Spirit Magazine, con integrate da racconti di Eisner e infine da nuove serie come "Life of Another Planet" e "The Big City".
Nel 1983 la Eclipse Comics pubblica in volume John Law Detective personaggio inedito del 1949 (storie in parte riciclate nel 1950 per The Spirit), e a fine anno esordisce il nuovo quadrimestrale della Kitchen Sink Will Eisner's Quaterly con "A Life Force" e altre serie.
Nel 1985 la Poorhouse Press pubblica il saggio di Eisner "Comics & Sequential Art" (che sarà pubblicato in Italia dalla Vittorio Pavesio Production),un testo fondamentale per l'interpretazione moderna del medium fumetto e per tracciarne i futuri sviluppi.
Nel 1987 viene realizzata una prima riduzione cinematografica di The Spirit, destinata alla televisione, su concessione dell'autore ma senza che lo stesso dia un personale contributo; il risultato ("The Spirit", giunto anche in Italia come "Il Fantasma") è tuttavia apprezzabile.
Le ultime realizzazioni a fumetti di Eisner sono spesso incentrate sull'incomunicabilità e sulla degradazione dei grandi centri urbani, e comunque hanno ormai la dimensione di autentici racconti e romanzi dove testi e immagini sono assolutamente integrati in una forma espressiva di grande originalità e alto valore artistico.
Ancora in piena attività e con molti progetti avviati, tra cui un nuovo film ispirato al suo personaggio più noto, a 87 anni il Maestro subisce una complessa operazione al cuore, ma sopravvengono improvvise complicazioni. Muore lunedì 3 gennaio 2005.
. Edizione italiana cronologica in volumi dell'intera produzione del personaggio.